為了直接評(píng)價(jià)MAOIs是否能在體內(nèi)重編程人TAM的極化，建立了人**/TAM異種移植NSG小鼠模型。A375人黑色素瘤細(xì)胞與健康供者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)分離的單核細(xì)胞混合，注射到NSG小鼠中形成實(shí)體瘤，接種后給予或不給予苯乙肼***（圖6h）。苯乙肼能有效抑制人TAMs的免疫抑制極化（圖6i-j）。接下來(lái)，研究了MAOI誘導(dǎo)的人TAM重編程是否會(huì)影響人T細(xì)胞的抗**活性，使用3D人**/TAM/T細(xì)胞類***培養(yǎng)。NY-ESO-1是一種公認(rèn)的**抗原，通常在多種人類**中表達(dá)，被選為模型**抗原。A375人黑素瘤細(xì)胞系設(shè)計(jì)為共表達(dá)NY-ESO-1及其匹配的MHC分子HLA-A2作為人**靶點(diǎn)（命名為A375-A2-ESO）。NY-ESO-1特異性人CD8+T細(xì)胞的構(gòu)建是通過(guò)將Retro/ESO-TCR編碼NY-ESO-1特異性TCR（命名為ESO-TCR）的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至健康供體外周血CD8+T細(xì)胞，將該細(xì)胞命名為ESO-T細(xì)胞，它表達(dá)ESO-TCRs，特異性靶向A375-A2-ESO**細(xì)胞，從而建立**特異性人CD8+T細(xì)胞模型。解決了對(duì)確定因果調(diào)節(jié)機(jī)制網(wǎng)絡(luò)的方法的關(guān)鍵需求。核受體與輔助調(diào)節(jié)因子
RASA1的上調(diào)消除了外泌體miR-335-5p對(duì)CRC細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用
為了進(jìn)一步確定RASA1在CRC細(xì)胞中的潛在功能，使用慢病毒載體建立了過(guò)表達(dá)RASA1的穩(wěn)定SW480細(xì)胞系。如圖6A和6B所示，在用表達(dá)RASA1的慢病毒載體（lenti-RASA1；SW480-RASA1）轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞中，實(shí)時(shí)PCR和蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證了RASA1mRNA和蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)。在過(guò)表達(dá)RASA1的細(xì)胞中，Ras和波形蛋白的蛋白質(zhì)水平顯著下調(diào)，而E-鈣粘蛋白上調(diào)。此外，與SW480載體對(duì)照相比，SW480-RASA1的遷移和侵襲能力顯著降低 人星形膠質(zhì)細(xì)胞高通量測(cè)序的后續(xù)成文服務(wù)。
作為一種典型的G蛋白偶聯(lián)受體， DRD2的內(nèi)化誘導(dǎo)其受體β-arrestin2在質(zhì)膜上的募集，并增加其與β-arrestin2的親和力。LPS和CM刺激了DRD2和β-arrestin2的蛋白-蛋白結(jié)合(圖5F-G)。同時(shí)，通過(guò)IF染色觀察到，經(jīng)過(guò)LPS處理后，DRD2似乎在細(xì)胞質(zhì)中與p-p65結(jié)合(圖5A)， Co-IP和IB進(jìn)一步證實(shí)了這種結(jié)合(圖5F)。據(jù)報(bào)道，β-arrestin2信號(hào)的***會(huì)破壞星形膠質(zhì)細(xì)胞中TAK1-Tab1的結(jié)合，而這種結(jié)合對(duì)于TAK1的***至關(guān)重要。本研究還證實(shí)，內(nèi)化的DRD2可以促進(jìn)TAB1與β-arrestin2的結(jié)合，削弱TAB1與TAK1的結(jié)合(圖5H)。綜上所述，DRD2***的β-arrestin2通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合TAB1來(lái)拮抗TAK1的磷酸化。
HA-Rab7T22N是一個(gè)不定位于晚期核內(nèi)體的顯性陰性突變體(補(bǔ)充圖3f)，它的表達(dá)也阻止了內(nèi)源性INPP4B的募集(圖3e)，表明活性的gtp結(jié)合的Rab7是INPP4B亞細(xì)胞定位到晚期核內(nèi)體所必需的。 GFP-INPP4B***提高了細(xì)胞內(nèi)PI(3)P水平(1.8倍)(圖3f)，PI(3,4)P2也存在于早期和晚期核內(nèi)體。表達(dá)INPP4B shrna的MCF-7細(xì)胞顯示出更明顯的細(xì)胞內(nèi)PI(3,4)P2斑點(diǎn)，表明INPP4B缺失抑制PI(3,4)P2在核內(nèi)體上的降解，導(dǎo)致其積累(圖3g)。GFP-INPP4B沒(méi)有改變PI(3) p陽(yáng)性早期核內(nèi)體的比例，但***增加了PI(3) p陽(yáng)性晚期核內(nèi)體的比例(1.7倍)(圖3h, i)。zVAD預(yù)處理也略微增加了IR后PTEN-398A細(xì)胞中未解決的DNA損傷灶的數(shù)量。
檢測(cè)TYRO3基因拷貝數(shù)與細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗**活性的相關(guān)性，CD8+T細(xì)胞水平與高表達(dá)TYRO3基因的患者的生存期延長(zhǎng)無(wú)關(guān)，但確實(shí)介導(dǎo)了低TYRO3基因拷貝數(shù)患者的生存期延長(zhǎng)，表明TYRO3降低細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗**作用的觀點(diǎn)。為進(jìn)一步確定TYRO3和抗PD-1***結(jié)果之間的相關(guān)性，分析接受抗PD-1***的黑色素瘤患者RNA-Seq數(shù)據(jù)中TYRO3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)耐藥**患者的TYRO3表達(dá)水平***高于**有反應(yīng)的患者。Westernblot分析也驗(yàn)證了TYRO3，p-TYRO3在4T1-R克隆中的表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明TYRO3對(duì)配體刺激有反應(yīng)。為進(jìn)一步確定TYRO3和抗PD-1/PD-L1耐藥性在各種**類型中是否普遍相關(guān)，我們研究了29例繼續(xù)接受抗PD-1/PD-L1***患者的***結(jié)果。抗PD-1/PD-L1***耐藥患者的TYRO3表達(dá)水平高于對(duì)***有反應(yīng)的患者。綜上所述，患者**組織中TYRO3的高表達(dá)和磷酸化與抗PD-1/PD-L1***的耐藥性相關(guān)。進(jìn)一步了解阻斷atm依賴的PTEN磷酸化如何影響細(xì)胞對(duì)基因毒性損傷的反應(yīng)。出生缺陷拷貝數(shù)
促*分泌體通過(guò)外泌體傳遞和運(yùn)輸是轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。核受體與輔助調(diào)節(jié)因子
3）LINC00926通過(guò)抑制乳腺*細(xì)胞中PGK1的表達(dá)來(lái)抑制糖酵解
由于PGK1是一種關(guān)鍵的糖酵解酶，而LINC00926被鑒定為負(fù)調(diào)控PGK1的lncRNA，我們想知道需氧糖酵解是否在LINC00926介導(dǎo)的乳腺*細(xì)胞增殖抑制中發(fā)揮作用。我們測(cè)試了LINC00926對(duì)葡萄糖攝取、乳酸生成和ATP生成的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，LINC00926降低了葡萄糖攝取、乳酸生成和ATP生成(圖3A)。在LINC00926轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，PGK1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了這些作用。LINC00926還顯示出細(xì)胞外酸化率下降(圖3B和3C)。PGK1在LINC00926轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中重新表達(dá)挽救了這些效果。在PGK1敲低的MDA-MB-231或MCF-7細(xì)胞中敲低LINC00926對(duì)糖酵解表型沒(méi)有影響(圖3D-3F)，表明LINC00926通過(guò)PGK1抑制糖酵解表型。綜上所述，LINC00926通過(guò)抑制乳腺*細(xì)胞中PGK1的表達(dá)來(lái)抑制糖酵解。 核受體與輔助調(diào)節(jié)因子
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4.二代測(cè)序：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、smallRNA測(cè)序、snoRNA測(cè)序、TRF測(cè)序
5.芯片：信號(hào)通路pcr芯片蛋白芯片
6.表觀遺傳實(shí)驗(yàn)：DNA甲基化實(shí)驗(yàn)（BSP,MSP，焦磷酸測(cè)序），RNA甲基化實(shí)驗(yàn)
7.實(shí)時(shí)定量PCR（mRNA,LncRNA,microRNA,circRNA）,WB，RNA功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(靶基因驗(yàn)證，過(guò)表達(dá)，干擾),基因突變及SNP檢測(cè)，F(xiàn)ISH，RNA-PULLdown，rip，chip實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞增殖，凋亡，流式等細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)