5、外泌體miR-934通過下調PTEN表達和***PI3K/AKT信號通路誘導巨噬細胞M2極化
進一步探索**來源的外泌體miR-934誘導M2巨噬細胞極化的機制。miR-934序列與PTEN的3'-UTR序列存在比對，提示miR-934可能靶向PTEN誘導M2巨噬細胞極化（Fig.5a）。如Fig.5b所示，將miR-934mimics或anti-miR-934及其控制載體轉染到PMA處理的THP-1細胞中，發現分別轉染miR-934mimics或anti-miR-934和PTEN野生型結合位點組中PTEN的3’-UTR熒光素酶活性***降低或升高（Fig.5b）。有趣的是，當細胞與轉染了anti-miR-934、miR-934mimics或其對照載體的HCT-8或HT29細胞的外泌體共培養時，熒光素酶活性模式顯示出與上述趨勢相同（Fig.5c）。此外，PMA處理的THP-1細胞轉染miR-934mimics或anti-miR-934，與各自的對照細胞相比，分別在mRNA和蛋白水平下調或上調了PTEN的表達（Fig.5d）。類似的，分別用轉染anti-miR-934或miR-934mimics的CRC細胞的外泌體孵育PMA處理的THP-1細胞，結果發現PTEN，PI3K/AKT的表達明顯高于或低于各自的對照組（Fig.5e,f）。這些表明在PMA處理的THP-1細胞中，外泌體來源的miR-934可以通過靶向其3'-UTR和***PI3K/AKT通路來下調PTEN的表達。 提供整體課題外包實驗構思。醫學相關課題動物模型構建
JAK-Stat6信號通路在介導IL-4/IL-13誘導TME中TAMs免疫抑制極化過程中起關鍵作用。IL-4/IL-13刺激后，JAK磷酸化，隨后Stat6磷酸化，磷酸化后的Stat6二聚并遷移至細胞核，然后與IL-4/IL-13相應基因，包括那些參與巨噬細胞免疫響應功能的基因的啟動子結合。據報道ROS可以促進JAK和Stat6磷酸化。因此，推測MAO-A可能通過上調ROS水平影響巨噬細胞極化，從而使JAK-Stat6信號通路敏感。事實上，直接分析從B16-OVA荷瘤MaoaWT和MaoaKO小鼠中分離的TAMs證實，與野生型TAMs相比，MAO-A缺陷的TAMs顯示Stat6***降低（圖4k-l）。進一步分析IL-4/IL-13誘導的JAK-Stat6信號通路，與在MaoaWTBMDMs中相比，在MaoaKOBMDMs中JAK-Stat6信號***下降，補充H2O2可使其JAK-Stat6信號達到與WT類似水平（圖4m）。這些數據表明MAO-A通過ROS致敏的JAK-Stat6通路***促進巨噬細胞免疫抑制極化。總之，這些體內外數據支持MAO-A促進TME中免疫抑制極化，通過上調TAM細胞內ROS水平，從而提高IL-4/IL-13誘導的JAK-Stat6信號通路。常規課題細胞實驗產生關于環境影響疾病的病因和分子機制的可測試的假設。
在s-flow條件下，KLF4的TF結合基元在E2中富集，而NRF1在E3和E4中富集(所有流條件下)(圖6B)。相比之下，暴露于d-flow條件下的E5 E8中，TEF、ETV3、RELA、FOS::JUN、TEAD1和STAT1的TF基序富集(圖6C)。對一些眾所周知的流量敏感tf的基模的鑒定，KLF4(與KLF2基模相同)，FOS:JUN (AP1)， RELA和TEAD1證實了我們分析的有效性。為了進一步確定新發現的TF結合基序是否也與流量依賴反應相關，我們檢測了phospho -STAT1水平是否對流量敏感，作為STAT1***的標記。pcl術后2周，與RCA相比，CDH5+ LCA的ECs中phosphoSTAT1水平***升高(圖6D和6E)。
METTL3增強APCmRNA的m6A和隨后的YTHDF結合抑制APC表達YTHDF1-3介導mRNA降解，針對YTHDF1的抗體進行RIP分析，實時定量PCR分析顯示，在KYSE180中，與APCmRNA結合的YTHDF2的數量遠遠多于YTHDF1和YTHDF3的數量，并且由于METTL3缺失而減少。這些結果表明METTL3增加了APCmRNA的m6A，在很大程度上促進了YTHDF2與APCmRNA的結合。為了研究YTHDF2與APCmRNA結合在APC表達中的作用，我們去除了YTHDF2，這增加了KYSE450細胞中APC的mRNA（圖5d和補充圖5e）和蛋白質表達。YTHDF1–3的聯合缺失進一步增加了這些細胞中APC的mRNA和蛋白質表達。此外，還進行了熒光素酶報告子分析，結果表明，缺失YTHDF2增強了由含m6A的WTAPCCDS序列驅動的熒光素酶活性，而突變的APC增強了熒光素酶活性，并使該活性抵抗了YTHDF2缺失的調節。此外，METTL3過表達抑制由WTAPCCDS序列驅動的熒光素酶活性通過YTHDF2耗竭恢復，其不影響突變的APC增強的熒光素酶活性。這些結果表明METTL3增加了APCmRNA的m6A，隨后的YTHDF結合抑制了APC的表達。解決了對確定因果調節機制網絡的方法的關鍵需求。
USF2促進circACTN4在BC中的表達為了研究 circRNA 在 BC發展中的功能，利用芯片分析檢測了4對BC組織和*旁組織中circRNA表達特征。共發現85個***差異表達的circRNAs， 63 個上調和22個下調circRNAs。熱圖顯示了14個上調的circRNA，其中circACTN4是失調**嚴重的一個，差異高達10倍。根據circBase數據庫發現circACTN4來自位于人類19號染色體上的ACTN4基因，產生于ACTN4外顯子2至外顯子7（共571bp），通過 Sanger 測序驗證了反向剪接連接點。為了驗證circACTN4的環形結構，使用聚斂引物和發散引物擴增環狀 circACTN4 和線性 ACTN4。通過FISH和核質分離PCR觀察到circACTN4主要位于BC細胞的細胞核中， circACTN4在*組織中的表達高于*旁組織。提供生物醫學領域內的課題思路設計。cancer課題技術指導
可以推斷基因調控事件之間的關系。醫學相關課題動物模型構建
4、外泌體miR-138-5p通過抑制KDM6B表達調節巨噬細胞極化
隨后，作者研究了在不同培養條件下TPH-1的表達譜。首先，和**細胞共培養抑制了M1相關基因的表達，IL-6，TNF-α，和IL-1β，但是增加了M2相關基因的表達CD163，Arg-1，IL-10,TGF-β和VEGFA。過表達KDM6B部分抑制了上述表現改變（圖4A-B）。流式檢測顯示乳腺*細胞和TPH-1的共培養增加了CD163陽性細胞數比例，但是過表達KDM6N可以抑制這種效果（圖6C）。類似的，過表達KDM6B抑制了miR-138-5p誘導的M2極化（圖4D-F）。與對照組相比，乳腺*來源的外泌體miR-138-5p降低了M1相關表型，相反，M2標志物增加并伴隨著CD163陽性細胞數的增加（圖6G-I）。用從乳腺*細胞中分離出來的外泌體處理THP-1細胞導致了M2極化，抑制miR-138-5p的表達可挽救這種極化（圖4J-L）。總之，這些結果表明外泌體miR-138-5p通過抑制KDM6B表達調節巨噬細胞極化。 醫學相關課題動物模型構建
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7.實時定量PCR（mRNA,LncRNA,microRNA,circRNA）,WB，RNA功能驗證實驗(靶基因驗證，過表達，干擾),基因突變及SNP檢測，FISH，RNA-PULLdown，rip，chip實驗以及細胞增殖，凋亡，流式等細胞功能學實驗