作者進行了PAR-CLIP實驗，以評估SLC7A11 mRNA-YTHDC2相互作用是否依賴于m6A甲基化。結果表明，在H1299細胞中，通過過表達METTL3來提高m6A的甲基化水平，促進YTHDC2與SLC7A11 mRNA的結合(圖6D)。無論METTL3是否過表達，YTH結構域的缺失都阻斷了SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用(圖6D)。作者通過SLC7A11 3’-UTR探針進行RNA-pull down實驗，發現YTHDC2WT，優先結合于含有m6A的SLC7A11 mRNA的3'UTR，而不是含有未甲基化腺苷的mRNA(圖6E)。此外，YTHDC2傾向于結合m6A共識基元GGAC (圖6E)。通過在H1299和H1975細胞中進行METTL3的功能增加和丟失實驗，發現細胞內SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用是由m6A水平決定的(圖6F和G)。這些數據表明YTHDC2優先與m6A甲基化的SLC7A11 mRNA結合。上海英拜提供課題外包服務。沈陽課題基礎實驗外包
在Jurkat和小鼠T細胞中檢測到多個肽上特異性磷酸化位點的***缺失，包括典型的CDK4/6靶標RB和RBL 1/2 (Fig. 3D-F)。值得注意的是，RB在兩種細胞蛋白組學中重疊，并且是全基因組CRISPR/Cas9篩選*****的（Fig. 3B，3G），表明CDK4/6i介導的記憶形成是由RB介導。因此，靶向敲除RB1，可以消除CD62L的表達上調(Fig. 3H)。3’RNA-seq分析顯示RB缺失廢除了轉錄對CDK4/6i的響應，包括SELL，其被CDK4/6i誘導的轉錄改變被RB缺失所大幅度減弱了(Fig. 3I)。與此一致，靶向敲除RB1也廢除了***的初級小鼠CD8+T細胞的Tcm形成(Fig. 3J)。遷移體課題整包服務小鼠正常胰腺(Npex)和小鼠PDAC細胞分離的外泌體呈現典型的外泌體結構。
YTHDC2調節SLC7A11 mRNA的穩定性(圖5A-D)，而控制RNA衰減是m6A甲基化的重要功能之一。作者先驗證METTL3刺激m6A的能力(圖5E、F)。在H1975細胞中敲降METTL3延長了SLC7A11 mRNA的半衰期，而在H1299細胞中過表達METTL3則加速了SLC7A11 mRNA的降解(圖5G)。此外，H1299細胞中降低METTL3表達阻斷了YTHDC2，從而減緩SLC7A11 mRNA的衰減，刺激胱氨酸攝取并減弱脂質活性氧(ROS)的生成(圖5H-J)，這表明YTHDC2在LUAD細胞中的作用是依賴m6A。
6.YTHDC2傾向于相互作用并使m6A甲基化的SLC7A11mRNA不穩定
為了揭示SLC7A11mRNA中潛在的m6A甲基化位點，在H1975細胞中METTL3敲除前后分別進行了MeRIP-seq研究。在H1975細胞中，無論是否敲除METTL3,GGACmotif都高度富集于m6A位點(圖6A)。m6A峰在mRNA停止密碼子附近的3’非翻譯區(3’UTR)尤為豐富(圖6B)。為了進一步證實SLC7A11mRNA的m6A依賴性修飾，我們進行MeRIP-qPCR。在H1975細胞中，敲除METTL3后，SLC7A11mRNA中的m6A修飾明顯減少，特別是在假定的m6A位點周圍。相反，當METTL3在H1299細胞中過表達時，觀察到相反的結果(圖6C)。
5）USP35通過靶向FPN調節鐵下垂
我們接下來試圖闡明USP35對鐵死亡的可能機制。負責鐵輸入的蛋白質(Tf和TfR)沒有改變；然而，哺乳動物中關鍵的鐵轉運蛋白FPN在USP35缺乏的細胞中減少，而在過表達的細胞中增加(圖6A-C)。在USP35過表達的*細胞中，細胞膜中的FPN蛋白豐度增加，但由于USP35的敲除而降低(圖6D)。與分子變化一致，在USP35沉默或過表達的細胞中，胱氨酸攝取也不受影響(圖6E)。為了進一步證實FPN的參與，H460和H1299細胞分別預***shFPN以敲低內源性FPN表達。USP35過表達在鐵刺激時降低了肺*細胞內LIP和Fe2+，但在FPN缺陷細胞中未能做到這一點(圖6F)。 提供生物醫學領域內的課題思路設計。
6、白樺素降低***的發展
用LDLR敲除小鼠探索了白樺素對***病變形成的作用。LDLR缺陷小鼠用WD飲食并分別添加了成分，對照（鹽），洛伐他汀（30mg/kg/day）或白樺素（30mg/kg/day）處理14周。不同組的小鼠顯示出相似的食物攝入量和體重（圖7A-7B）。在經白樺素處理的小鼠肝臟中，SREBP-1c和SREBP-2降低，脂質合成基因（包括HMGCS，HMGCR和FAS）下調（圖7C）。但是，洛伐他汀可上調HMGCR和FAS基因的表達（圖7C）。白樺素極顯著降低了血液中的TC，TG和LDL-c的含量，并增加了HDL-c。洛伐他汀具有類似的作用，只是它不降低TG（圖7D–7G）。與對照處理的小鼠相比，洛伐他汀或白樺素處理的小鼠的主動脈斑塊的數量和大小顯著降低（圖7H和7I）。特別是，主動脈弓（圖7J）和胸主動脈（圖7K）的病變區域明顯較小。以上數據表明，白樺素降低了WD喂養的LDLR敲除小鼠***病變的形成，并穩定了主動脈根部粥樣硬化斑塊。
總之，本文確定了SREBP的一種特定的小分子抑制劑，即betulin白樺素，可以降低脂質水平，增強胰島素敏感性并減少***斑塊的形成。 這些數據支持以下觀點：抑制SREBP途徑可能是***II型糖尿病和***的有用策略。 Betulin可以作為藥物控制代謝性疾病的主要化合物。 IGF-1信號在Pex誘導的肝纖維化中起重要作用。CRO課題
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Blimp-1在持續刺激下抑制PGC1α
持久抗原對于改變向衰竭分化至關重要，但其代謝后果尚不清楚。由于連續的刺激不產生明顯的代謝抑制，持續的刺激可能***一個轉錄抑制因子，阻止代謝重編程。Blimp-1(由Prdm1編碼)就是這樣一種抑制因子，在B16黑色素瘤中**終耗盡的CD8+ T細胞中高度上調(圖4a)，并在缺氧條件下持續***(圖4b)。體外缺氧條件下持續***的T細胞也抑制PGC1α的表達(圖4c)。 進一步確定Blimp-1是否可以抑制PGC1α，發現強制表達Blimp-1可以抑制293T細胞中Ppargc1a啟動子構建的活性，而不影響其活力(圖4d)。Prdm1f/fCd4Cre小鼠的CD8+ T細胞通過在缺氧條件下持續***而抵抗功能障礙(圖4e,f)，而在持續***條件下無法抑制Ppargc1a的表達(圖4g)。在PD-1hiTim3+ TILs中，Blimp-1的缺失導致了通過IL-2和**壞死因子(TNF)產生的線粒體質量和多功能性的恢復(圖4h, i)。 沈陽課題基礎實驗外包
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