作者進行了PAR-CLIP實驗，以評估SLC7A11 mRNA-YTHDC2相互作用是否依賴于m6A甲基化。結果表明，在H1299細胞中，通過過表達METTL3來提高m6A的甲基化水平，促進YTHDC2與SLC7A11 mRNA的結合(圖6D)。無論METTL3是否過表達，YTH結構域的缺失都阻斷了SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用(圖6D)。作者通過SLC7A11 3’-UTR探針進行RNA-pull down實驗，發現YTHDC2WT，優先結合于含有m6A的SLC7A11 mRNA的3'UTR，而不是含有未甲基化腺苷的mRNA(圖6E)。此外，YTHDC2傾向于結合m6A共識基元GGAC (圖6E)。通過在H1299和H1975細胞中進行METTL3的功能增加和丟失實驗，發現細胞內SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用是由m6A水平決定的(圖6F和G)。這些數據表明YTHDC2優先與m6A甲基化的SLC7A11 mRNA結合。提供生物醫學領域內的課題思路設計。甘油三酯課題協同創作
七、急性腎損傷和慢性腎臟疾病患者PT_VCAM1的比例升高
對小鼠缺血再灌注損傷(IRI)實驗中獲得的大量RNA-seq進行反卷積，以確定PT_VCAM1的比例是否與急性腎損傷有關。BisqueRNA使用基于scRNA-seq參考的反褶積方法從整體RNA-seq中估算細胞類型的豐度。PT_VCAM1估計比例在iri后24h***增加，并持續至少7天;與正常近端小管細胞比例下降相對應(圖7a)。有趣的是，未手術控制小鼠腎臟中PT_VCAM1的估計比例在老齡小鼠中增加(圖7b)。用BisqueRNA對非**腎樣本進行反卷積，估計PT_VCAM1細胞的比例為2.6%(圖7d)，這與我們的snRNA-seq和snatc-seq估計一致。接下來，我們分析了來自2型糖尿病患者腎臟活檢的大量RNA-seq。與對照組和早期糖尿病腎病患者相比，晚期糖尿病腎病患者PT_VCAM1的比例明顯更高(圖7e)，提示PT_VCAM1和小管損傷可能與糖尿病腎病的疾病進展有關。從小鼠IRI到人類的細胞類型標記轉移表明，大部分PT_VCAM1與我們**近在小鼠中發現的修復失敗的近端小管細胞(FR-PTC)群體有關(圖7c)。 RNA甲基化課題基礎實驗外包我們使用抗體陣列評估了表達PTEN- wt或PTEN- 398a的MCF10A細胞裂解液的應激反應和凋亡通路的活性。
circPLCE1通過編碼circPLCE1-411抑制CRC細胞增殖和遷移
為了探索circPLCE1-411的生物學功能，我們進行了細胞實驗。結果表明，轉染circPLCE1或circPLCE1-411的CRC細胞可抑制集落形成、球的形成、不依賴于錨定的生長和PDOs生長。然而，用帶有起始密碼子突變體的circPLCE1載體(circPLCE1-ATGmut)轉染對CRC細胞增殖沒有影響。此外，細胞遷移和傷口愈合實驗也顯示，轉染circPLCE1或circPLCE1-411載體可抑制CRC細胞遷移和侵襲，而轉染circPLCE1-ATGmut對CRC細胞遷移沒有影響。這些數據表明，circPLCE1通過編碼circPLCE1-411而不是circPLCE1的circRNA形式來抑制CRC細胞的增殖和遷移。
2020年12月，埃默里大學在Cell Rep（IF=8.087） 雜志上發表了文章“Endothelial Reprogramming by Disturbed Flow Revealed by Single-Cell RNA and Chromatin Accessibility Study”。此報道在PCL后，使用從小鼠頸動脈腔內獲得的富含內皮細胞的單細胞和細胞核進行了scRNA-seq和scATAC-seq檢測，以確定d-flow和s-flow對基因轉錄本和染色質可及性譜的基因組和表觀基因組調控的差異影響。對scRNA-seq和scATAC-seq數據的單獨分析以及對兩個數據集的綜合分析顯示，即使在s-flow下，頸動脈內的ECs也是異質性的。D-flow***改變了內皮轉錄組和表觀基因組譜，將它們重新編程為炎癥細胞、間充質細胞、干細胞/祖細胞樣細胞、造血細胞和免疫細胞樣表型。此外，我們還發現了一種依賴于d-flow和s-flow的TF結合位點和順式調節元件的富集。zVAD預處理也略微增加了IR后PTEN-398A細胞中未解決的DNA損傷灶的數量。
三、沿著推斷分化軌跡的Motif可及性動態
由于技術限制，scRNA-seq難以檢測低豐度轉錄本（如轉錄因子TFs），而通過染色質的可及性可推斷出這些TFs的活性，因此整合scRNA-seq和scATAC-seq方法具有重要意義。研究者利用scATAC-seq檢測了人類胚胎Lin- CD34+ CD38-細胞的單細胞染色質可及性，分別對18、20和21PCW胚胎的肝臟和股骨中的4,001個細胞進行了測序，基于SNN算法，共得到7個不同的可明顯分離的集群 (Figure 3A)。scRNA-seq數據中檢測了所選標記基因的可及性，與干細胞相關的標記基因(如MLLT3、PROM1、FLI1和GATA2)的可及性較高，而與不同譜系相關的基因(如MPO、ALAS2、MPEG1和CD19)的可及性較低，這與分選細胞的未分化特性一致(圖3B)。生成的軌跡顯示出兩個分支，每個分支的染色質可及性和分化有明顯的趨勢(圖3D和3E)。 按照實驗設計路線和實驗結果進行文章的構思與潤色。lncRNA課題CRO
TIMEOR是***個基于 Web 的自適應時間序列多組學管道方法。甘油三酯課題協同創作
6、tiRNA-Gly通過RBM17調節增殖或遷移相關基因的選擇性剪接
由于RBM17是一種參與mRNA選擇性剪接的剪接體蛋白，研究tiRNA-Gly在與RBM17結合時是否調節下游基因的選擇性剪接將是一項有趣的研究。對過表達tiRNA-Gly后的K1細胞系進行RNA測序，所有的選擇性剪切事件如6A所示，外顯子跳躍（cassette外顯子）占37.67%，A5SSs剪接占6.78%，A3SSs剪接占4.99%，備選***外顯子(AltStart)剪接占18.19%，備選末端外顯子（AltEnd）剪接占18.74%，互斥事件（MEXs）占5.12%，內含子保留剪接（IR）占8.51%。外顯子跳躍顯然是tiRNA-Gly誘導的**頻繁的選擇性剪接事件。MAP4K4、POSTN、HACE1、DPP9和BRCA1是外顯子跳躍導致表達變化比較大的基因。tiRNA-Gly誘導了MAK4K4第16外顯子的跳躍，POSTN第21外顯子的跳躍，HACE1第8外顯子的跳躍，DPP9第21外顯子的跳躍和BRCA1第13外顯子的跳躍（圖6B）。如圖6C-D所示，升高的tiRNA-Gly誘導了MAP4K4一個截斷型(NM_4834.4)的mRNA水平，降低了一個長型(NM_1242560.1)的mRNA水平，而下調的RBM17則起相反的作用。重要的是，RBM17的敲除阻斷了由tiRNA-Gly誘導的MAP4K4截斷變體(NM_4834.4)的增加，表明tiRNA-Gly誘導的選擇性剪接依賴于RBM17。 甘油三酯課題協同創作
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4.二代測序：轉錄組測序、smallRNA測序、snoRNA測序、TRF測序
5.芯片：信號通路pcr芯片蛋白芯片
6.表觀遺傳實驗：DNA甲基化實驗（BSP,MSP，焦磷酸測序），RNA甲基化實驗
7.實時定量PCR（mRNA,LncRNA,microRNA,circRNA）,WB，RNA功能驗證實驗(靶基因驗證，過表達，干擾),基因突變及SNP檢測，FISH，RNA-PULLdown，rip，chip實驗以及細胞增殖，凋亡，流式等細胞功能學實驗