1）DRD2通過啟動子甲基化在轉(zhuǎn)錄上下調(diào)
為了研究新的潛在TSGs，采用BrCa組織和正常組織進行RNA-seq篩選。與正常乳腺組織相比，BrCa組織中DRD2mRNA表達明顯下調(diào)(圖1A)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，與BrCa組織相比，正常乳腺組織中DRD2蛋白水平也較高(圖1B)。同樣，基于TCGA，在BrCa中也觀察到DRD2mRNA的下調(diào)，并且在BrCa中DRD2啟動子甲基化也更頻繁(圖1C)。根據(jù)Kmplot，DRD2的高表達促進了BrCa患者的更長的生存期，這也在HER2陽性基因型患者中可見。但這一優(yōu)勢在LuminalA患者中未見(圖1D)。根據(jù)RT-PCR和MSP結果，幾乎所有的BrCa細胞系與永凍的正常乳腺細胞系相比，都可以看到DRD2mRNA表達下調(diào)或缺失以及啟動子甲基化(圖1E)。因此，DRD2的高甲基化頻率可能有助于其下調(diào)BrCa。Aza藥物去甲基化恢復了兩種沉默的BrCa細胞系MDA-MB231和BT549中DRD2的表達(圖1F)。 小鼠正常胰腺(Npex)和小鼠PDAC細胞分離的外泌體呈現(xiàn)典型的外泌體結構。HE染色課題基礎實驗外包
3.IRES序列
由于circRNA是共價閉環(huán)分子，沒有游離末端，因此circRNA的翻譯必須使用一種非經(jīng)典的啟動機制，即不依賴5’-帽子的翻譯啟動。這種起始途徑往往通過IRES（內(nèi)部核糖體進入位點）驅(qū)動，IRES是具有特殊二級結構的短RN**段。在病毒中發(fā)現(xiàn)并證明了大量的IRES元件，在一些特殊情況下，哺乳動物內(nèi)源性的IRES元件也可以起始翻譯。作者團隊也曾針對circRNA中IRES元件進行了系統(tǒng)性的篩選驗證。數(shù)據(jù)庫也使用了所有可用的IRES信息作為支持circRNA翻譯的證據(jù)。 醫(yī)學基礎實驗課題課題設計英拜生物對實驗可行性分析。
一、腦損傷改變了果蠅的大腦蛋白質(zhì)組，擾亂了NCT蛋白和Nup蛋白水平
為了研究創(chuàng)傷性腦損傷的機制，我們使用了一個具有良好特征的創(chuàng)傷性腦損傷果蠅模型，該模型顯示了強大的表型，如TDP-43同源物(Tbph)、p62、應激顆粒和泛素病理，以識別和研究創(chuàng)傷性腦損傷后大腦蛋白質(zhì)組的變化(圖1A)。對暴露于重復TBI的三齡果蠅幼蟲大腦中的2000個蛋白質(zhì)進行了無偏性蛋白質(zhì)組學分析(w1118)，發(fā)現(xiàn)361個蛋白質(zhì)在創(chuàng)傷損傷后發(fā)生了***變化(p 0.05，學生t檢驗)?；诨虮倔w論(GO)的復雜網(wǎng)絡分析在BiNGO (Cytoscape 3)中對tbi相關腦蛋白質(zhì)組與非tbi對照進行了關聯(lián)分析，確定了不同類別的改變蛋白，其中大多數(shù)上調(diào)(圖1B和C;圖1圖補充1A-E;補充文件1和3)。TBI后上調(diào)的比較高類別是微管細胞骨架、蛋白質(zhì)折疊和蛋白酶體。此外，我們還鑒定了涉及**白復合體和剪接體的蛋白質(zhì)。核孔復合體(NPC)和NCT通路的組成部分是tbi后上調(diào)的主要蛋白子集(圖1圖補充1F)。
接下來，我們合成了野生型HuR蛋白(WT)和HuR蛋白的截短突變體（即分別為單獨HuR的RNA識別基序(RRM)1的突變體B1、單獨HuRRRM2的突變體B2和單獨HuRRRM3的突變體B3）（圖4C）。同時，我們設計并合成了生物素標記的或未標記的探針，分別特異性靶向lnc-PMIF的中心-莖環(huán)和生物素標記的或未標記的探針，特異性靶向之前報道的與HuR蛋白相互作用的β-actinmRNA的序列。RNA電泳遷移率變動分析(EMSA)發(fā)現(xiàn)只有當生物素標記的lnc-PMIF探針與WTHuR或截短突變體B3共孵育時，才能檢測到lnc-PMIF-HuR復合物，這表明HuR的RRM3可介導HuR和lnc-PMIF之間的相互作用。lnc-PMIF與β-actinmRNA競爭與HuR相互作用。過表達HuR-RRM3后細胞中β-actin的mRNA和蛋白表達下降***上調(diào)，遷移活性增強。所有這些表明lnc-PMIF可與HuR的RRM3結合，中斷HuR-β-actin的相互作用，抑制β-actin的表達，抑制OPC的遷移。產(chǎn)生關于環(huán)境影響疾病的病因和分子機制的可測試的假設。
5）MAPK1-109aa對胃*有抑制作用
為了進一步研究MAPK1-109aa的生物學功能，我們將circMAPK1ATG突變質(zhì)粒、circMAPK1IRES突變質(zhì)粒和circMAPK1過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到MKN45和BGC823細胞中。如預期的那樣，當轉(zhuǎn)染ATG突變質(zhì)粒和IRES突變質(zhì)粒時，沒有出現(xiàn)circMAPK1編碼的MAPK1-109aa13-kDa帶(圖5a)。CCK8實驗(圖5b)、集落形成實驗(圖5c，d)和EdU實驗(圖5e，f)顯示過表達circMAPK1明顯抑制了細胞的增殖能力。流式細胞術顯示，處于S期的GC細胞數(shù)量也明顯減少(圖5g)。然而，當circMAPK1的ATG或IRES序列發(fā)生突變時，MKN45和BGC823細胞的增殖能力沒有明顯變化。 上海英拜提供課題外包服務。分子生物學課題
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**近有報道稱，ALS/FTD中TDP-43的聚集可以隔離核孔蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白和其他因子，表明TDP-43的聚集強烈破壞核質(zhì)轉(zhuǎn)運(NCT)和核孔復合體。此外，在AD、ALS和亨廷頓氏病(HD)中NCT也被破壞，提示在這些神經(jīng)退行性疾病中有一個共同的功能失調(diào)途徑。然而，TDP-43在反復顱腦損傷致神經(jīng)退行性變中的病理機制尚不清楚。此報道之前曾證明，重復的創(chuàng)傷導致果蠅大腦中的泛素、p62和TDP-43包涵體以及應激顆粒病理。在這里，我們對果蠅的大腦進行了蛋白質(zhì)組學分析，以確定創(chuàng)傷損傷后改變的分子通路。2021年5月，在Elife雜志上發(fā)表了文章“TraumaticinjurycompromisesnucleocytoplasmictransportandleadstoTDP-43pathology.”。此報道在體內(nèi)，反復的創(chuàng)傷會上調(diào)核孔蛋白，改變核孔蛋白的穩(wěn)定性，改變NCT蛋白，改變Ran***1和核孔蛋白的分布，改變NCT。此外，核輸出的藥理抑制可以防止tbi介導的致命性和NCT缺陷。有趣的是，在體內(nèi)和體外，核孔蛋白的上調(diào)導致TDP-43定位錯誤、聚集、磷酸化和溶解性改變，并降低運動功能和壽命。對NUP62病理和CTE患者腦組織中NUP62濃度升高的研究結果表明NCT缺陷與創(chuàng)傷損傷有關，這可能介導了TDP-43的病理變化。HE染色課題基礎實驗外包
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