一、PBMC單核、單細(xì)胞ATAC序列優(yōu)化
A.snATAC、scATAC和ICICLE-seq方法的主要步驟概要。ficoll純化的PBMCs和白細(xì)胞分離純化的PBMCs之間的一個(gè)主要區(qū)別是ficoll純化樣品中存在殘留的中性粒細(xì)胞。我們使用熒光***細(xì)胞分選(FACS)從高中性粒細(xì)胞含量的PBMC樣本中檢測(cè)去除死細(xì)胞和碎片的方法，包括去除中性粒細(xì)胞和不去除中性粒細(xì)胞。
B.這種單核分析利用低滲裂解、洗滌劑和皂苷的組合來分離細(xì)胞核，而不保留線粒體DNA。使用這種方法進(jìn)行snATAC-seq，測(cè)序，并將數(shù)據(jù)質(zhì)量指標(biāo)(材料和方法)制成表格后，鑒定了兩個(gè)主要的細(xì)胞條碼群體。細(xì)胞核制備的scATAC-seq文庫包含更多來自核小體DN**段的reads，而來自細(xì)胞核的非細(xì)胞條形碼(灰線)包含的這些片段比細(xì)胞條形碼更多。 circNDUFB2通過增強(qiáng)泛素/蛋白酶體依賴性降解降低IGF2BPs的穩(wěn)定性。microRNA標(biāo)書廣州
轉(zhuǎn)座酶染色質(zhì)可及性單核測(cè)序(snATAC-seq)也是一種單細(xì)胞表觀遺傳組測(cè)序技術(shù)。單細(xì)胞核測(cè)序，能夠獲得組織的細(xì)胞圖譜，解決細(xì)胞異質(zhì)性的問題。單細(xì)胞或細(xì)胞核RNA測(cè)序(scRNA-seq或snRNAseq)促進(jìn)了對(duì)定義腎臟細(xì)胞特性的基因和途徑的更深入的理解。成熟的人類和小鼠腎臟的多個(gè)scRNAseq圖譜已經(jīng)確定了轉(zhuǎn)錄如何有助于細(xì)胞類型的特異性。**近的方法已經(jīng)將這種方法擴(kuò)展到單細(xì)胞染色質(zhì)可及性分析。單核染色質(zhì)轉(zhuǎn)置可及性測(cè)序試驗(yàn)(snATACseq)是ATAC-seq的擴(kuò)展，該試劑盒利用Tn5轉(zhuǎn)置酶在數(shù)千個(gè)單個(gè)細(xì)胞中測(cè)量染色質(zhì)可及性。醫(yī)學(xué)相關(guān)標(biāo)書動(dòng)物模型構(gòu)建第4周測(cè)定FITC標(biāo)記的葡聚糖(4kd)和血液中FITC水平。
4）DRD2重編程的Mφ誘導(dǎo)**細(xì)胞的焦亡
如HE所示，來自小鼠模型的**承載DRD2顯示**細(xì)胞死亡增加(圖4A)。在免疫組化染色中，表達(dá)DRD2的4T1**樣本中pMLKL表達(dá)較高(圖4A)。根據(jù)TUNEL實(shí)驗(yàn)，DRD2也促進(jìn)了體內(nèi)細(xì)胞凋亡(圖4B)。DRD2上調(diào)GSDME而不是GSDMD(圖4C)。在crosstalk過程中，Mφ進(jìn)一步促進(jìn)了DRD2轉(zhuǎn)染的BrCa細(xì)胞中GSDME的表達(dá)(圖4C)。在表達(dá)DRD2的BrCa細(xì)胞中，Mφ也能上調(diào)IL-1β(圖4C)。WB結(jié)果表明，DRD2誘導(dǎo)了MLKL的磷酸化，而在共培養(yǎng)過程中，MLKL被Mφ抑制(圖4D)。此外，DRD2表達(dá)***了caspase-8，而***被Mφ抑制(圖4D)。假設(shè)，DRD2可能在與Mφcrosstalk時(shí)誘發(fā)焦亡。BrCa細(xì)胞中與Mφ共培養(yǎng)時(shí)，NLRP3在表達(dá)DRD2的BrCa細(xì)胞中被觸發(fā)。***的caspase-1蛋白水解也能誘導(dǎo)IL-1β和IL-18的成熟(圖4D)。在共培養(yǎng)過程中，Cleavedcaspase-3表達(dá)上調(diào)(圖4D)。此外，在共培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)表達(dá)DRD2的BrCa細(xì)胞中，GSDME的N端發(fā)生了剪切(圖4D)。為了確定是否由M1Mφ引起焦亡，我們使用了LPS誘導(dǎo)的M1Mφ培養(yǎng)基，結(jié)果表明，在表達(dá)DRD2的BrCa細(xì)胞中，M1Mφ*觸發(fā)NLRP3組裝并剪切GSDME(圖4E)。以上結(jié)果提示，M1Mφ以DRD2依賴的方式觸發(fā)BrCa細(xì)胞的焦亡。
1肺腺*(LUAD)細(xì)胞及其細(xì)胞系中均可通過選擇性剪接產(chǎn)生mRNAPD-L1亞型LncRNAPD-L1
為探索LUAD不同階段PD-L1蛋白的表達(dá)量異，對(duì)PD-L1蛋白陽性和陰性樣品均進(jìn)行了mRNAPD-L1表達(dá)的檢測(cè)，結(jié)果在198bp和92bp處都擴(kuò)增出了條帶。Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，198bp條帶與PD-L1mRNA序列相匹配，而92bp處條帶為非編碼亞型PD-L1（PD-L1-Lnc）(Fig1A，右下圖)。為進(jìn)一步證實(shí)，設(shè)計(jì)了探針對(duì)缺失片段進(jìn)行檢測(cè)，在878bp和705bp處檢測(cè)出兩條條帶，878bp條帶與PD-L1mRNA序列相匹配，而705bp的條帶顯示與PD-L1mRNA相比，第4個(gè)外顯子中存在106nt的序列缺失，第5個(gè)和第6個(gè)外顯子之間存在67nt的缺失。通過BASESCOPE顯色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在肺*組織中mRNAPD-L1（藍(lán)點(diǎn)）和LncRNAPD-L1（紅點(diǎn)）存在明顯的共表達(dá)（Fig1C）；接下來，作者設(shè)計(jì)了PD-L1mRNA和PD-L1-Lnc的特異性探針，對(duì)這些RN**段進(jìn)行定量，通過PCR探針擴(kuò)增并進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)到PD-L1蛋白陽性和陰性樣品中在PD-L1mRNA和PD-L1-ln數(shù)量一致 FMT處理調(diào)節(jié)SCI小鼠的腸道微生物組成。
M2極化是抗**巨噬細(xì)胞，即與M1極化相比，促**的**相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）高表達(dá)白細(xì)胞介素-4受體（IL4R）。本研究中，作者利用M1巨噬細(xì)胞來源的外泌體，通過重編程TAMs為M1型巨噬細(xì)胞，從而促進(jìn)M1極化和靶向IL4R，**終抑制**生長(zhǎng)。本文于2021年9月發(fā)表在《Biomaterials》IF：12.479期刊上。
M1外泌體的特性以促進(jìn)M1極化和靶向IL4R
超離心法從M1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基分離出每只小鼠20~30μg的外泌體。然后為了通過IL4R靶向M2巨噬細(xì)胞，使用DOPE-PEG-NHS膜磷脂為基礎(chǔ)的錨定物（IL4Rp-1-Exo(si/mi)），用IL4Rp-1對(duì)Exo(si/mi)進(jìn)行表面修飾。NTA分析顯示M1外泌體、Exo(si/mi)、IL4R-Exo(si/mi)和IL4Rpep-1標(biāo)記的M1外泌體(IL4R-Exo)相似。此外，M1和M2巨噬細(xì)胞外泌體都有相似水平的Alix和CD63表達(dá)，但是M1有更高的iNOS表達(dá)和更富豐的促炎性因子（IL-6，IL-12，IFN-γ）；并且細(xì)胞裂解液中含有細(xì)胞標(biāo)記物，如鈣聯(lián)蛋白和組蛋白，但外泌體中不含，這表明外泌體中不含死細(xì)胞的細(xì)胞碎片。 為鑒定IGF2BPs泛素化的E3連接酶對(duì)RNA下拉沉淀物進(jìn)行質(zhì)譜分析。山西標(biāo)書服務(wù)價(jià)格
肺*是**常診斷的**之一也是大多數(shù)國(guó)家**死亡的主要原因。microRNA標(biāo)書廣州
已有研究表明，甘氨酸結(jié)構(gòu)域和Pur-α中的PUR重復(fù)結(jié)構(gòu)域可能負(fù)責(zé)招募RNA分子，因此作者構(gòu)建了Pur-α全長(zhǎng)和截?cái)噘|(zhì)粒。RIP檢測(cè)結(jié)果表明PUR重復(fù)域(66-246aa)與CircCwc27直接結(jié)合。作者進(jìn)一步研究了CircCwc27對(duì)Pur-α的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CircCwc27的下調(diào)并不影響總Pur-αmRNA和蛋白水平，但CircCwc27引起的Pur-α沉淀的水平***上調(diào)。與野生型小鼠相比，APP/PS1和APP/PS1-lv-sh-Circon小鼠中CircCwc27沉淀的Pur-α***上調(diào)。在APP/PS1小鼠中敲低CircCwc27，CircCwc27和Pur-α的結(jié)合***降低。RIP測(cè)定也得到了類似的結(jié)果。由于CircCwc27主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，并且在AD中上調(diào)，我們探討了增強(qiáng)CircCwc27和Pur-α之間的結(jié)合是否影響了Pur-α的分布。免疫印跡結(jié)果顯示，APP/PS1小鼠中Pur-α在細(xì)胞核中的表達(dá)明顯減少，而在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)明顯增加。注射LV-shCircCwc27可***促進(jìn)Pur-α的分布。microRNA標(biāo)書廣州
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4.二代測(cè)序：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、smallRNA測(cè)序、snoRNA測(cè)序、TRF測(cè)序
5.芯片：信號(hào)通路pcr芯片蛋白芯片
6.表觀遺傳實(shí)驗(yàn)：DNA甲基化實(shí)驗(yàn)（BSP,MSP，焦磷酸測(cè)序），RNA甲基化實(shí)驗(yàn)
7.實(shí)時(shí)定量PCR（mRNA,LncRNA,microRNA,circRNA）,WB，RNA功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(靶基因驗(yàn)證，過表達(dá)，干擾),基因突變及SNP檢測(cè)，F(xiàn)ISH，RNA-PULLdown，rip，chip實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞增殖，凋亡，流式等細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)