由于腸道微生物群在多囊卵巢綜合征的起始和發(fā)展中起著重要作用，作者還研究DHEA和tempol是否影響腸道的氧化還原狀態(tài)。腸道MDA、3-NT和AGEs水平在PCOS大鼠中***高于對照組和氧化生物標(biāo)記的增加被tempol處理消除(圖3K-M)。此外，tempol***增加PCOS大鼠的腸道SOD1和SOD2表達(dá)(圖3N)。因此，這些結(jié)果表明tempol能夠降低PCOS大鼠的腸道氧化應(yīng)激。
4.Tempol減輕PCOS大鼠腸道微生物失調(diào)
隨后，通過rarefaction和Shannon曲線(Fig.4A-B)，以及4個α-多樣性指數(shù)(ACE)、Shannon、Simpson和Chao1來評估細(xì)菌群落的豐度和多樣性。當(dāng)序列增加到2000時多個樣本稀疏曲線往往是平坦的，這表明測序數(shù)據(jù)的數(shù)量是合理的(圖4C-F)。在多個樣本Shannon曲線也觀察到類似的結(jié)果(圖4g)，表明大多數(shù)樣本多樣性被測序覆蓋。有趣的是，rarefaction和Shannon曲線以及4個α-多樣性指數(shù)的結(jié)果在不同組間沒有差異(圖4A-F)，這表明DHEA處理或tempol干預(yù)對腸道微生物群α-多樣性沒有明顯影響。 小鼠正常胰腺(Npex)和小鼠PDAC細(xì)胞分離的外泌體呈現(xiàn)典型的外泌體結(jié)構(gòu)。可參觀實驗課題第三方實驗室
4）CircMAPK1編碼109個氨基酸的新蛋白MAPK1-109aa
根據(jù)在線數(shù)據(jù)庫circRNADb的預(yù)測結(jié)果，circMAPK1序列中包含一個開放閱讀框，起始密碼子為ATG，IRES位于274-327nt。這一觀察結(jié)果表明circMAPK1具有編碼109aa蛋白的潛能，本研究將其命名為MAPK1-109aa(圖4a)。為了驗證預(yù)測的IRES在circMAPK1中的活性，我們進(jìn)行了雙熒光素酶檢測，結(jié)果顯示野生型IRES報告基因的熒光素酶活性明顯高于突變型IRES報告基因的熒光素酶活性(圖4b)。為了進(jìn)一步證實MAPK1-109aa的存在，我們將circMAPK1IRES突變質(zhì)粒和circMAPK1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞。銀染色結(jié)果顯示，在分子量為13kDa時存在明顯的蛋白帶，與MAPK-109aa的預(yù)測大小一致。MS檢測到AMEIMLNSKLCL序列，與MAPK1-109aa含有特定C端序列LCL的氨基酸序列一致(圖4c)。為了檢測該多肽產(chǎn)物，我們使用了一種識別MAPK1中間部分的抗體(圖4d)。WesternBlot檢測40對胃*組織(圖4e)和細(xì)胞系(圖4f)中MAPK1-109aa和MAPK1的水平。 chip課題外泌體CD44v6和C1QBP可能是預(yù)測PDAC患者預(yù)后的有前途的生物標(biāo)志物。
4）體外實驗表明，上調(diào)UCP1以減輕AKI期間的脂質(zhì)積累，可通過影響炎癥和凋亡，***抑制疾病進(jìn)展
越來越多的證據(jù)表明，在AKI中有明顯的脂質(zhì)積累和UCP1的異常表達(dá)，并與腎損傷的嚴(yán)重程度有很強(qiáng)的相關(guān)性。為了確定脂質(zhì)積累是否影響AKI期間的細(xì)胞功能，我們首先使用UCP1過表達(dá)慢病毒和UCP1激動劑CL316243構(gòu)建AKI細(xì)胞脂質(zhì)積累***模型。如圖4A所示，在AKI中上調(diào)UCP1***脂質(zhì)積聚，導(dǎo)致腎小管損傷指數(shù)、NGAL***下調(diào)，說明UCP1***脂質(zhì)積聚可***減輕模型細(xì)胞的損傷。鑒于炎癥和凋亡是AKI細(xì)胞損傷**重要和直接的原因，我們對上述細(xì)胞模型中的炎癥和凋亡標(biāo)記物進(jìn)行了量化。IL-1β、IL-6和TNF-α隨著UCP1的上調(diào)而***降低(圖4B-D)。在凋亡指標(biāo)Bax和C-caspase3中也觀察到類似的趨勢，而Bcl-2升高(圖4E)。***，通過TUNEL熒光染色直接定量評估細(xì)胞凋亡，證實上調(diào)UCP1緩解AKI模型細(xì)胞的凋亡(圖4F)。
7）在體外，上調(diào)UCP1減少AKI期間的脂質(zhì)積累可通過AMPK/ULK1途徑促進(jìn)自噬
自噬已被證實在AKI中發(fā)揮重要作用。因此，自噬已經(jīng)成為我們關(guān)注的重要途徑之一。在通過慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)UCP1或UCP1激動劑CL316243的AKI細(xì)胞模型中，自噬相關(guān)指標(biāo)顯示AMPK/ULK1/自噬通路******(圖7A-B)。電子顯微鏡圖像也顯示，上調(diào)UCP1消除AKI中的脂質(zhì)積累后，細(xì)胞自噬得到促進(jìn)(圖7C)。基于這些發(fā)現(xiàn)，為了驗證自噬在UCP1功能中的重要性，我們進(jìn)行了功能恢復(fù)實驗。如圖7D-F所示，氯喹抑制自噬***逆轉(zhuǎn)了順鉑組UCP1引起的炎癥指標(biāo)下降。同樣，TUNEL染色顯示，使用氯喹抑制自噬，可以明顯逆轉(zhuǎn)UCP1促進(jìn)的凋亡抑制作用(圖7G)。這些結(jié)果表明，脂質(zhì)積累通過作用于AKI細(xì)胞自噬，在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能方面發(fā)揮著重要作用。 ATM對PTEN的磷酸化驅(qū)動細(xì)胞周期進(jìn)程。
circACTN4增加遷移和侵襲并調(diào)節(jié)BC細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程
為了進(jìn)一步評估circACTN4在BC進(jìn)展中的作用，在circACTN4過表達(dá)或敲低后研究了BC細(xì)胞的遷移、侵襲和細(xì)胞周期。劃痕和transwell試驗表明，BC細(xì)胞的侵襲和遷移能力因circACTN4的上調(diào)而顯著增加，但被circACTN4的下調(diào)顯著抑制。WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)或敲低BC細(xì)胞中MMP9和MMP2蛋白水平明顯升高或降低，nm23-H1表達(dá)明顯降低或升高。式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期分析，結(jié)果顯示與對照組相比，circACTN4的敲低導(dǎo)致S期BC細(xì)胞比例較低，G1期BC細(xì)胞比例較高，這表明circACTN4沉默導(dǎo)致G1期阻滯BC細(xì)胞。此外，WB顯示BC細(xì)胞中敲低circACTN4后，CDK4、CCNE1和CCND1蛋白水平顯著下調(diào)，這可能阻止了BC細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。 英拜提供生物醫(yī)學(xué)課題外包服務(wù)。過表達(dá)課題檢測服務(wù)
我們接下來研究了Pex對HSCs生物學(xué)行為的影響。可參觀實驗課題第三方實驗室
LC3陽性囊泡在質(zhì)膜損傷后在修復(fù)部位積聚用激光照射*細(xì)胞MCF7，致使細(xì)胞膜上形成小孔。使用膜不可滲透的FM1-43染料測量膜完整性，發(fā)現(xiàn)在Ca2+存在下，細(xì)胞能夠在20到30s內(nèi)修復(fù)它們的質(zhì)膜(Fig.1,AandB,left)；在缺乏Ca2+的培養(yǎng)基中受損的細(xì)胞無法修復(fù)并繼續(xù)吸收細(xì)胞不可滲透的染料(Fig.1B,right)。使用穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)-LC3的MCF7細(xì)胞研究激光照射后自噬是否參與該過程，結(jié)果顯示，LC3陽性點在損傷后大約8-10min開始在修復(fù)部位形成（Fig.1C）；在未損傷區(qū)域中LC3陽性點未增加（Fig.1D）；LC3依賴于ATG7（Fig.1E-H）。可參觀實驗課題第三方實驗室
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