外泌體專用培養(yǎng)基 VS 去外泌體血清，誰贏了？

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（MSC EXOs）近年來已經(jīng)在傷口愈合、神經(jīng)損傷、肝病以及新冠肺炎等領(lǐng)域被廣泛研究應(yīng)用。不少研究表明，在各種損傷和疾病模型中，MSC EXOs 可以作為間充質(zhì)干細(xì)胞的替代選擇。

第四軍醫(yī)大學(xué)去年就在干細(xì)胞領(lǐng)域權(quán)威期刊 Stem Cell Research & Therapy 發(fā)表文章[1]，發(fā)現(xiàn) MSC EXOs 逆轉(zhuǎn)肝纖維化，是間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）治療肝臟疾病的重要機(jī)制。MSC EXOs 正逐漸成為再生醫(yī)療領(lǐng)域的「新武器」，也為臨床疾病研究提供新思路。

如何通過高純度外泌體？加快研究速度

外泌體相關(guān)研究越來越熱，賽道也愈發(fā)精細(xì)，如何巧用外泌體，并讓它服務(wù)于自己的課題呢？不論是 MSC EXOs 還是其他外泌體，高純度提取一直是實(shí)驗(yàn)的前提。

本文分享 3 個(gè)影響外泌體結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，并給到大家詳細(xì)的培養(yǎng)操作步驟參考，并總結(jié)操作過程中的 4 個(gè)常見 QA 帶你提升外泌體純度。

01 3 個(gè)因素影響外泌體結(jié)果準(zhǔn)確性

1. 血清：常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)使用胎牛血清 FBS + 基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，但是胎牛血清中富含外泌體，后續(xù)培養(yǎng)后收集的細(xì)胞上清中的外泌體不確定是從細(xì)胞分泌的還是血清中來的，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2. 營養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)是需要一定的營養(yǎng)的，那么如果不加血清，單獨(dú)只用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)，嚴(yán)重影響細(xì)胞生長，甚至出現(xiàn)吞噬外泌體的現(xiàn)象，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3. 雜蛋白：去外泌體胎牛血清可以很好地解決 1、2 中涉及的問題，但還會(huì)存在雜蛋白影響蛋白定量結(jié)果，導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏高，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。如果使用外泌體專用無血清培養(yǎng)基（專門針對外泌體獲取的培養(yǎng)基，化學(xué)成分明確，類似于完全培養(yǎng)基的一種介于血清和無血清之間的營養(yǎng)狀態(tài)），滿足腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞等細(xì)胞增殖的同時(shí)，可以降低雜蛋白等的影響，獲取更高純度的外泌體。

要提取外泌體，前期的細(xì)胞培養(yǎng)是研究的根基，樣本準(zhǔn)備是影響整個(gè)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵所在。以下是「細(xì)胞上清外泌體提取操作指南」，助你提升外泌體提取純度，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

02 外泌體提取操作指南

1. 細(xì)胞復(fù)蘇及傳代：細(xì)胞復(fù)蘇后使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng) 2～3 代至細(xì)胞生產(chǎn)狀態(tài)正常；

2. 階段培養(yǎng)一：待細(xì)胞匯合度約為 50% 時(shí)，移去原有完全培養(yǎng)基，添加新培養(yǎng)基（50% 外泌體專用無血清培養(yǎng)基 + 50% 完全培養(yǎng)基）；

3. 階段培養(yǎng)二：待細(xì)胞在梯度培養(yǎng)一中生長匯合度約為 70～80% 時(shí)，移去原有的 50% 外泌體專用無血清培養(yǎng)基 + 50% 完全培養(yǎng)基；

4. 使用 1X PBS 溶液將細(xì)胞潤洗 2～3 次；

5. 加入外泌體專用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 24～48 h，待細(xì)胞匯合度到 90%～100% 時(shí)收取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，該上清液即可用于外泌體提取實(shí)驗(yàn)。

*注：若使用 DMEM、1640 等常規(guī)培養(yǎng)基，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)的細(xì)胞上清中外泌體含量很少，因?yàn)榧?xì)胞在饑餓狀態(tài)下會(huì)將囊泡作為營養(yǎng)物質(zhì)吸收（如圖 1-B ）。這樣的換培養(yǎng)基操作主要目的是為了保證細(xì)胞要有密度差，確定細(xì)胞在正常生長，融合度的數(shù)值不是固定的。此培養(yǎng)基無法替代常規(guī)培養(yǎng)基，只可用于 48 h 以內(nèi)短時(shí)間培養(yǎng)理論上細(xì)胞狀態(tài)好可以循環(huán)多次實(shí)驗(yàn)。

A：無外泌體血清組

B：正常血清組

C：外泌體專用無血清培養(yǎng)基組

圖 1 三種不同的培養(yǎng)體系的外泌體 TEM 電鏡圖（Hela 細(xì)胞）

通過 TEM 電鏡結(jié)果圖可以簡單評估外泌體純度，背景越干凈，外泌體呈現(xiàn)越清晰，說明本身提取的外泌體純度越高。圖 1 中使用三種不同的培養(yǎng)體系培養(yǎng)細(xì)胞后提取外泌體，其中專用無血清培養(yǎng)基組還是背景較干凈，說明該組外泌體純度最高。

03 4 個(gè)外泌體提取常見問題及解析

看來外泌體專用無血清培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)過程中，起到關(guān)鍵作用，但在實(shí)際操作時(shí)依舊可能會(huì)發(fā)生「意外問題」，如：換液時(shí)間拿不定、專用無血清培養(yǎng)基使用時(shí)機(jī)不好把握等等，以下 4 個(gè)常見問題與解決方案帶你「防患于未然」，更好地運(yùn)用外泌體無血清培養(yǎng)基，讓實(shí)驗(yàn)更順利。

Q：用濃縮后的外泌體感染細(xì)胞，是否可以使用正常的培養(yǎng)基？感染后需要多久進(jìn)行換液？

A：在外泌體和細(xì)胞共孵育實(shí)驗(yàn)過程中，建議使用無血清培養(yǎng)基來完成，4～6 小時(shí)進(jìn)行換液。若使用高營養(yǎng)的血清培養(yǎng)基，可能存在其他物種外泌體的干擾，因?yàn)樵诟郀I養(yǎng)情況下，細(xì)胞對于目的外泌體的吸收能力可能會(huì)下降。

Q：外泌體專用無血清培養(yǎng)基使用時(shí)機(jī)，是在細(xì)胞誘導(dǎo)成模前，還是加藥后？是否可以用本培養(yǎng)基配藥？

A：1. 正式實(shí)驗(yàn)前先預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測實(shí)驗(yàn)細(xì)胞是否能在外泌體專用培養(yǎng)基中正常生長增殖。

2. 如果預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有問題，正式實(shí)驗(yàn)中，可以用外泌體專用培養(yǎng)基配藥進(jìn)行培養(yǎng)收集，可能問題是收集的培養(yǎng)上清中含藥物，不清楚藥物信息，不確定藥物是否會(huì)影響外泌體提取的效果。

3. 外泌體專用培養(yǎng)基不適用于傳代細(xì)胞培養(yǎng)，無促細(xì)胞貼壁因子。

4. 如果實(shí)驗(yàn)細(xì)胞不適應(yīng)外泌體專用培養(yǎng)（營養(yǎng)成分不足，增殖不顯著），則可選擇去外泌體血清配置的培養(yǎng)基培養(yǎng)收集培養(yǎng)上清提取外泌體。

Q：外泌體專用培養(yǎng)基是否可用于重懸、接種以及繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞

A：不可以。不能在傳代后就換此基礎(chǔ)培養(yǎng)基（例如 DMEM、1640 等基礎(chǔ)培養(yǎng)基），該培養(yǎng)基中沒有促使細(xì)胞貼壁的因子。外泌體專用培養(yǎng)基可以維持細(xì)胞一定時(shí)間的生長，但無法替代完全培養(yǎng)基，也很難達(dá)到完全培養(yǎng)基的效果。

A：現(xiàn)已有用戶將該培養(yǎng)基用于除腫瘤細(xì)胞和 T 細(xì)胞外的其他細(xì)胞并發(fā)表文章。保險(xiǎn)起見，建議您在正式實(shí)驗(yàn)前先預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測實(shí)驗(yàn)細(xì)胞是否能在外泌體專用培養(yǎng)基中正常生長增殖。因?yàn)橥饷隗w專用培養(yǎng)基不適用于傳代細(xì)胞培養(yǎng)，無促細(xì)胞貼壁因子，如果實(shí)驗(yàn)細(xì)胞不適應(yīng)外泌體專用培養(yǎng)（營養(yǎng)成分不足，增殖不顯著），則可選擇去外泌體血清配置的培養(yǎng)基培養(yǎng)收集培養(yǎng)上清提取外泌體。

想要數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，一定要選擇有文獻(xiàn)應(yīng)用、驗(yàn)證可靠的培養(yǎng)基。上文實(shí)驗(yàn)方法和 QA，均基于使用下方兩個(gè)好物的外泌體提取實(shí)驗(yàn)，多篇文獻(xiàn)引用驗(yàn)證[2,3]，質(zhì)量可靠，為你的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航～

直擊文中好物

1 外泌體專用無血清培養(yǎng)基

Umibio® 外泌體專用培養(yǎng)基含有 HEPES，L-Glutamine, Pharm Grade Albumin, Hypoxanthine, Thymidine, Phenol Red, Glucose（偏低糖 2 g/L）. 無動(dòng)物源 Xeno-free, Serum-free，不含生長因子（Growth factors），細(xì)胞培養(yǎng)過程中無需添加血清即可達(dá)到完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)狀態(tài)。該培養(yǎng)基更方便，不需要再配置，降低污染概率，有利于外泌體的收獲。更適合腫瘤細(xì)胞和 T 細(xì)胞，不適合傳代培養(yǎng)。

2 去外泌體胎牛血清

Umibio® 去外泌體胎牛血清由無菌采集的健康胎牛血清過濾而成，去除 ≥ 99% 的胎牛血清內(nèi)源外泌體，并與處理前的胎牛血清具相同的細(xì)胞生長速率和形態(tài)。去外泌體血清則營養(yǎng)更充足，細(xì)胞活性更好；適用細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)，收獲目標(biāo)細(xì)胞的外泌體。

文獻(xiàn)引用：

[1]. Tian, S., Zhou, X., Zhang, M. et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes protect against liver fibrosis via delivering miR-148a to target KLF6/STAT3 pathway in macrophages. Stem Cell Res Ther 13, 330 (2022). 

[2]. Song, T.; Zhou, M.; Li, W.; Zheng, L.; Wu, J.; Zhao, M. Tripeptide Leu-Ser-Trp Regulates the Vascular Endothelial Cells Phenotype Switching by Mediating the Vascular Smooth Muscle Cells-Derived Small Extracellular Vesicles Packaging of miR-145. Molecules 2022, 27, 7025. 

[3]. Yanglin Zhu, Hong Qin, Chenglu Sun, Bo Shao, Guangming Li, Yafei Qin, Dejun Kong, Shaohua Ren, Hongda Wang, Zhaobo Wang, Jingyi Zhang, Hao Wang, "Endometrial Regenerative Cell-Derived Exosomes Attenuate Experimental Colitis through Downregulation of Intestine Ferroptosis", Stem Cells International, vol. 2022, Article ID 3014123, 15 pages, 2022.